最近很多一线实验室的PCR人反馈：“内标半数不起”、“内标曲线Ct值偏大”、“内标时期时不起”......很是困扰。针对这个想象，小六依据多年实践工作经验及异常曲线问题处理经验，与大家分享“内标曲线异常”的处理思路。

首先，确认扩增曲线分析设置是否正确

查看是否设置了合适的基线和阈值线。

其次，确认内标的类型

我们知道，新冠病毒核酸检测试剂盒的内对照分为：内源性内标和外源性内标。

内源性内标，常采用的是样本中固有的人体细胞中的管家基因，如RNase P等人源基因，这些基因在人体各器官组织细胞中普遍存在，存在于采集的咽拭子等标本中，因此可以检测是否采集到了上皮细胞及整个实验操作过程的准确性，由于人基因组和病毒提取效率存在一定差别，内源性内标无法完全监测提取过程中存在的问题。

外源性内标，常用的是MS2噬菌体等假病毒，在临床标本制备前加入，然后与标本中的靶核酸一起经历核酸提取过程，可以较全面地监测从核酸提取到产物分析全过程的有效性。外源性内标不但可以监测标本中PCR抑制物及核酸提取中试剂的混入所致的假阴性外，而且还可以监测因为PCR扩增仪孔位间温度的不准确及核酸的提取效率太低所致的假阴性。

与内源性人源基因相比，外源性内对照不能监控标本采集的质量，需要提前制备并作为试剂盒的一个组分。

1.如果实验室使用的试剂盒为内源性内标

内源性内标，为人体细胞中的管家基因，监测的是样本采集及提取、扩增全过程。

内源性内标不起线或者Ct值偏大，考虑因素：

①标本采集方面：

标本是环境/物体标本or人源标本？

→环境/物表标本：标本中正常无人源性内标

→人源标本：标本中采集到的细胞数量是否足够

②若人员标本，除考虑采样中细胞数量是否足够外，还用考虑标本提取效率和扩增效率。

→提取效率：采用磁珠法进行核酸提取的标本，提取过程中会因为标本中干扰物质多或者提取仪问题导致提取后的核酸样本中含有抑制物。

例如，标本中含有较多粘液或者血液时样本裂解不充分，或者，提取仪问题导致提取后的核酸中有残留的磁珠等，都会抑制后续的扩增反应。

还有可能，因为添加蛋白酶K的核酸提取体系与后续核酸扩增的试剂之间有抑制。（这类问题有案例，提取样本时添加蛋白酶K后扩增发现内标不起或者Ct值偏大；待复检时不加蛋白酶K提取样本后扩增内标正常。这类情况只局限于几家厂家的扩增试剂，因此，实验室在开展新冠病毒核酸检测前一定要对实验室的检测系统进行性能验证。）

→扩增效率：扩增效率受八连管/96孔板和qPCR仪状态影响。八连管/96孔板不洁净会抑制扩增，影响扩增效率；qPCR仪孔间温度不均会影响扩增效率，或者，孔内有灰尘等影响荧光值。

2.如果实验室使用的试剂盒为外源性内标

外源性内标，为假病毒，在样本提取核酸前加入，然后与样本中的靶核酸一起经历核酸提取过程，可以较全面地监测从核酸提取到产物分析全过程的有效性。不但可以监测样本中PCR抑制物及核酸提取中试剂的混入所致的假阴性外，还可以监测因为qPCR仪扩增孔位间温度的不准确及核酸的提取效率太低所致的假阴性。

因此，如果样本间提取效率和扩增效率的一致性较好，则内标的Ct值应相近。

外源性内标不起线或者Ct值偏大，考虑因素：提取效率和扩增效率。（与内源性内标分析原因一致）

附：“内标曲线异常”处理思路图

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